From hypothesis to experiment

随着越来越多的蛋白质被计算方法自动标注，社区中仍然存在一个明显的 gap：我们生成蛋白质功能假设的速度越来越快，但验证这些功能假设的速度仍然非常慢。

在这里，我们尝试对“从一个 hypothesis 开始，到最后完成实验验证”的过程进行一次系统性的归纳和梳理。

需要注意的是，在本文中，我们所说的 hypothesis 指的是一段描述蛋白质功能、性质或作用机制的自由文本。它可以来自传统的序列/结构比对方法，也可以来自机器学习模型、深度学习模型，或者最近的多模态大模型。

从 hypothesis 到最终实验验证，我们可以把整个过程大致分成三个层面：

• 概念层
  • hypothesis
  • claims
• 中间层
  • sub-claims
  • assays
• 物理层
  • protocols
  • devices / human operators

接下来，我们分层进行阐述。

中间层

中间层是连接概念层和物理层的层次。

概念层处理的是 hypothesis、claim 这类自然语言或半结构化的科学命题；物理层处理的是 protocol、instrument、sample、operator、device 这类可以被实验室系统执行的对象。中间层的作用，就是把一个上游 claim 转换成物理层能够理解、执行和回填结果的形式。

换句话说，中间层回答的问题不是：

这个 hypothesis 听起来是否合理？

也不是：

实验人员应该一步一步怎么操作？

而是：

为了判断这个 claim 是否成立，我们需要拆成哪些更小的、可实验判定的 sub-claims？   每个 sub-claim 应该由什么类型的 assay 来产生证据？   什么样的实验结果支持它，什么样的实验结果拒绝它，什么样的结果只能说明证据不足？

因此，中间层主要包含两个核心对象：

1. Sub-claim
2. Assay

Sub-claim 和 Assay 是一体两面的关系。

• Sub-claim 更接近概念层。它的任务是把上游 claim 拆解成若干个更小、更明确、更可实验判定的命题。
• Assay 更接近物理层。它的任务是把某个 sub-claim 绑定到一套可以产生证据的实验设计中，包括 readouts、controls、replicates、support criteria、refutation criteria 等。

可以简单理解为：

需要注意的是，凭空生成 assay 是不可靠的。一个 sub-claim 是否可以被某类 assay 支持，应该尽量依赖已有的人类知识库、标准实验范式、文献、数据库或实验室内部 SOP，而不是只由语言模型直接想象出来。

因此，从 sub-claim 到 assay 的过程更合理的方式是：

1. Retrieve：从已有知识库、文献、protocol database 或实验室 SOP 中检索相关 assay。
2. Rank：根据 sub-claim 的对象、关系、条件、readout 需求，对候选 assay 进行排序。
3. Adapt：如果已有 assay 不能完全匹配当前 sub-claim，则以已有 assay 作为模板进行微调。
4. Justify：记录为什么选择这个 assay，它对应哪个 sub-claim，哪些地方是从已有模板修改而来。
5. Validate：检查 assay 的 readouts 是否真的能够支持或拒绝对应的 sub-claim。

最后，在中间层结束之前，需要安排一次内容检查。因为中间层的输出会直接影响物理层的实验执行，所以必须确保这里的逻辑拆解、assay 选择和判定标准都是一致的。否则，上游 claim 的表达错误、sub-claim 的拆解错误，或者 assay 与 sub-claim 的错配，都会污染最后的实验结果。

Sub-claims

Sub-claim 是从 claim 中拆解出来的、更小的、可实验判定的科学命题。

一个 claim 往往太大、太抽象，不能直接进入实验层。例如：

This protein functions as a receptor for insulin-like growth factors (IGFs).

这个 claim 看起来很清楚，但如果要实验验证，就会立刻遇到很多问题：

• 这里的 IGFs 指的是 IGF-1、IGF-2，还是更广义的 IGF-like ligands？
• “functions as a receptor” 是只要求 ligand binding，还是还要求 downstream signaling？
• 这个 receptor function 是在体外体系中判断，还是在细胞环境中判断？
• 如果这个蛋白能结合 IGF-1 但不能结合 IGF-2，算不算支持原始 claim？
• 如果它能结合 IGF ligand，但不能激活下游 signaling，算不算 receptor？

这些问题说明，claim 需要被拆成更明确的 sub-claims。

Sub-claim 的目标不是把一句话机械地切成更短的句子，而是要把 claim 拆成可以分别获得证据、分别判断状态、并最终组合回原始 claim 的局部命题。

一个好的 sub-claim 通常应该满足以下条件：

1. 对象明确      例如，不只是说 “binds IGFs”，而是明确为 “binds IGF-1” 或 “binds IGF-2”。

2. 关系明确      例如，是 binding、activation、inhibition、localization，还是 pathway regulation。

3. 判定方向明确      应该能说清楚什么结果支持它，什么结果拒绝它，什么结果只能算 inconclusive。

4. 能够映射到 assay      Sub-claim 本身仍然是概念层命题，但它必须足够具体，以便后续可以找到对应的 assay。

每一个 sub-claim 至少需要包含以下信息：

这里需要区分三种状态：

也就是说，sub-claim 的结果不应该被强行二分成“支持”和“拒绝”。在真实实验中，很多结果既不能支持也不能拒绝，只能说明当前 assay、样本、条件或 readout 不足以做出判断。

例子：将 IGF receptor claim 拆解为 sub-claims

假设上游 claim 是：

如果我们暂时采用一个相对弱的定义：

只要该蛋白能特异性结合至少一种 IGF ligand，就认为它在 ligand-binding 意义上支持 IGF receptor claim。

那么可以拆成两个 sub-claims：

这时，支持或拒绝上游 claim 的规则可以写成：

support(C0) = supported(S1) OR supported(S2)
refute(C0) = refuted(S1) AND refuted(S2)
inconclusive(C0) = NOT support(C0) AND NOT refute(C0)

也就是说：

但是，如果我们采用一个更强的定义：

一个 functional IGF receptor 不仅要能结合 IGF ligand，还需要在相关 context 中触发 receptor activation 或 downstream signaling。

那么上面的拆解就不够了。我们还需要增加一个 sub-claim：

这时，强版本 claim 可以写成：

support(C0_strong) = (supported(S1) OR supported(S2)) AND supported(S3)
refute(C0_strong) = (refuted(S1) AND refuted(S2)) OR refuted(S3)
inconclusive(C0_strong) = NOT support(C0_strong) AND NOT refute(C0_strong)

这说明，同一个原始 claim 可以有不同强度的形式化版本。中间层需要明确当前使用的是哪一种定义，否则后面的 assay 设计会变得混乱。

Sub-claim 形式化表示

对于上面的例子，可以把 sub-claims 写成下面的结构：

这个例子展示了 sub-claim 的作用：它不是直接给出实验步骤，而是把一个较大的 claim 拆成可以被 assay 分别判断的小命题，并且为每个小命题定义清楚支持、拒绝和不确定的条件。

Assay

Assay 可以定义为：

“a planned process with the objective to produce information about the material entity that is the evaluant, by physically examining it or its proxies”

也就是说，assay 是一个有计划的过程，它的目标是通过对评估对象 (evaluant) 本身或其替代物 (proxies) 进行物理检查，从而产生关于该实体的信息。引用

用更通俗的话来说，一个 assay 至少包含四个关键点：

1. 它是一个有计划的过程
   Assay 不是随便观察一下，而是事先设计好的检测过程。
   例如，随手拿起一管蛋白对着灯看一下，不算 assay；按照一个明确方案测定蛋白浓度，则可以算 assay。

2. 它的目标是产生信息
   Assay 的直接目标是获得数据或判断，而不是获得产物。
   例如，纯化蛋白的主要目标是得到蛋白样品，因此它本身通常不是 assay；测定蛋白浓度的目标是获得关于蛋白样品的信息，因此它是 assay。

3. 它需要物理检查 evaluant 或 proxy
   Assay 不是纯粹的推理、想象或文献检索，而是需要对某个物质实体或其替代信号进行检测。
   例如，测量吸光度、荧光、质谱信号、结合响应、细胞成像信号，都属于通过物理手段获取信息。

4. 它可以直接检查对象本身，也可以检查 proxy
   有些性质不能直接观察，因此需要通过 proxy 来判断。
   例如，酶活性本身不是一个可以直接“看见”的物体，但底物消耗、产物生成、吸光度变化或荧光变化可以作为 enzyme activity 的 proxy。

因此，assay 的作用不是重复 sub-claim，而是把 sub-claim 转换成一套可以获得证据的实验设计。

Assay 和 Sub-claim 的区别

Sub-claim 和 Assay 都包含 criteria，但二者的 criteria 含义不同。

例如，对于 sub-claim：

This protein specifically binds IGF-1.

它的 sub-claim support criteria 可以是：

存在可重复的、特异性的 IGF-1 binding evidence，并且能够排除明显的 nonspecific binding。

但是到了 assay 层，就必须进一步绑定到具体 readout。例如，如果选择 SPR binding assay，那么 assay criteria 可能会写成：

观察到浓度依赖的 binding response；可以拟合出合理的 binding curve；negative control 不显示明显结合；competition 或 reference ligand 能够支持结合特异性。

也就是说：

sub-claim criteria = 概念上的证据要求

assay criteria = 绑定具体 readout 后的操作性判定标准

二者必须一致。一个 assay 不能只因为产生了某种信号就自动支持 sub-claim。它必须产生与 sub-claim statement 直接相关的证据。

Assay 至少需要包含的信息

对于一个 assay 来说，至少需要记录以下信息：

需要注意，assay 仍然不是 protocol。Assay 说明“要测什么、用什么类型的方法测、读出什么信号、如何判定结果”；而 protocol 才说明“第一步加什么、第二步孵育多久、第三步用什么参数上机”。

这里的 “具体” 不是指 assay 已经包含逐步操作流程。
Assay 应该具体到足以让系统选择或生成 protocol，但不直接替代 protocol。

更准确地说，assay 是一个 execution-ready test specification：

• 它需要绑定 experimental context、instrument class 或具体仪器平台、consumables、controls、readouts 和 criteria；
• 它需要说明什么样的仪器输出会被解释为 support、refutation 或 inconclusive；
• 但它不规定每一步操作的体积、时间、温度、plate layout、仪器 method file 和 operator action sequence。

这些逐步执行细节属于 protocol 层。

Assay 不应该脱离 Sub-claim

一个常见错误是：先想到某个常见 assay，然后强行把它绑定到 claim 上。

例如，对于 claim：

This protein functions as a receptor for IGFs.

如果我们直接说：

做一个 Western blot。

这其实是不充分的。因为 Western blot 本身只是一个技术平台，它可以用于检测蛋白表达、蛋白大小、磷酸化状态或其他修饰，但它并不自动回答“这个蛋白是否是 IGF receptor”。

只有当我们明确了 sub-claim，比如：

IGF stimulation leads to phosphorylation of this protein.

这时，Western blot 才可能成为一个 assay 的组成部分：

因此，assay 的选择必须由 sub-claim 驱动，而不是由实验技术本身驱动。

从 Sub-claim 到 Assay 的匹配过程

从 sub-claim 生成 assay 时，不应该直接让模型凭空创造实验方案。更合理的流程是：

sub-claim
  -> generate operational statement
  -> match assay type from top hierarchy of assay database
  -> retrieve and rank assay candidates from assay database
  -> review if assay candidates need modification
  -> adapt selected assay and record parent assay id
  -> define readouts, criteria and metadata

具体来说：

1. Generate operational statement

虽然 sub-claim 已经是一个较小的科学命题，但它通常还不是一个可以直接匹配 assay 的实验性陈述。

例如：

This protein specifically binds IGF-1.

这个 sub-claim 仍然缺少很多实验上下文信息，例如：

• 是在 purified protein 体系中检测 binding，还是在细胞表面检测 ligand binding？
• evaluant 是重组蛋白、表达该蛋白的细胞，还是膜组分？
• ligand 是 purified IGF-1、标记后的 IGF-1，还是固定在 sensor chip 上的 IGF-1？
• readout 预期是 binding response、fluorescence signal、competition signal，还是其他 proxy？

因此，第一步需要把 sub-claim 改写成一个更接近实验设计的 operational statement。

例如：

Test whether the purified candidate protein shows specific, concentration-dependent binding to recombinant IGF-1 in an in vitro ligand-binding assay.

或者：

Test whether cells expressing the candidate protein show specific IGF-1 binding compared with matched negative-control cells.

Operational statement 的作用是把原始 sub-claim 中隐含的对象、关系、上下文和 readout 需求显式化。它仍然不是 protocol，但已经足够用于后续匹配 assay type 和 assay template。

2. Match assay type from top hierarchy of assay database

Assay database 可以被组织成一个树状结构。第一层通常是最粗粒度的 assay type，例如：

• ligand binding assay
• enzyme activity assay
• cell-based activation assay
• localization assay
• interaction assay
• expression assay

在这一步，我们需要把 operational statement 先绑定到一个或多个高层 assay type。

例如，对于：

Test whether the purified candidate protein shows specific, concentration-dependent binding to recombinant IGF-1.

它首先应该被匹配到：

ligand binding assay

而不是直接跳到某个具体 protocol。

这样做的好处是，中间层可以先确定“这个 sub-claim 需要哪一类证据”，再进入更细粒度的 assay 检索。否则系统可能会因为看到某些关键词，就过早选择一个并不真正对齐 sub-claim 的实验技术。

3. Retrieve and rank assay candidates from assay database

确定高层 assay type 之后，下一步是在 assay database 中检索候选 assay。

检索可以基于多种信息进行，例如：

• sub-claim statement
• operational statement
• evaluant 类型
• ligand、substrate、analyte 或 perturbation
• readout 需求
• experimental context
• required instruments
• organism、cell type 或 sample type
• 已有 assay template 的标签、描述和适用范围

检索方式可以是关键词检索、结构化字段过滤、embedding 相似度检索，也可以由 LLM 先拆解 operational statement，再生成检索条件。

候选 assay 返回后，需要进行排序。排序时不应该只看文本相似度，而应该重点考虑 assay 是否真正匹配当前 sub-claim 的证据需求。

例如可以考虑：

这一步的输出不是最终 assay，而是一组排序后的 candidate assays。

4. Review whether assay candidates need modification

对于排序靠前的 assay candidates，需要检查它们是否可以直接用于当前 operational statement。

如果某个 candidate assay 在 evaluant、context、readout、controls 和 criteria 上都与 operational statement 对齐，那么它可以被直接选中，并绑定到当前 sub-claim。

例如：

selected_assay_id: A123
sub_claim_id: S1
assay_template_id: T_ligand_binding_SPR_001
assay_template_reviewed: true
adaptation_required: false

但如果候选 assay 只是部分匹配，就不能直接使用。例如：

• assay 检测的是 EGF binding，但当前 sub-claim 是 IGF-1 binding；
• assay 使用的是 purified protein，但当前需要 cell-surface binding；
• assay 有 readout，但缺少 competition control；
• assay 能检测 binding signal，但不能判断 specificity；
• assay 的 refutation criteria 不适用于当前样本或 context。

这时就需要进入 adaptation，而不是把 candidate assay 原样绑定到 sub-claim。

5. Adapt selected assay and record parent assay id

如果没有完全匹配的 assay，可以选择一个或多个最相关的 assay 作为 parent assays，并在此基础上生成新的 assay specification。

这里的 adaptation 应该是对已有 assay 模板的受控修改，而不是凭空生成。

需要记录的信息至少包括：

assay_id: A_new
parent_assay_ids:
  - A123
  - A087
adaptation_required: true
assay_template_reviewed: false
adaptation_summary:
  - replaced original ligand with IGF-1
  - added competition control to assess binding specificity
  - changed evaluant from purified receptor domain to full-length protein-expressing cells
adaptation_reason: >
  No existing assay template directly matched the operational statement.
  The selected parent assays were adapted because they share the same
  target relation, similar readout logic, and compatible control structure.

一个 adapted assay 必须显式标记为：

assay_template_reviewed: false

除非它之后经过人类专家或实验负责人 review。

这样做的目的有两个：

1. 保留 assay 来源的可追溯性；
2. 区分“已有、经过审核的 assay template”和“由系统基于已有模板改写出的 assay specification”。

这对于后续质量控制非常重要。因为 adapted assay 虽然可能合理，但它仍然需要经过人工审查，才能进入物理层生成 protocol 或直接执行。

6. Define readouts, criteria and other metadata

选定或改写 assay 之后，需要把 assay 中与执行和判定相关的 metadata 明确记录下来。

这一步不是写 protocol，而是把 assay specification 补全到足以支撑后续 protocol generation。

至少需要明确：

其中最关键的是：criteria 必须绑定到具体 readouts，而不能只写成泛泛的“结果显著”或“有阳性信号”。

例如，对于 IGF-1 binding assay，criteria 应该围绕 binding response、dose-dependence、negative control、competition control、background signal 等 readouts 来定义。只有这样，assay result 才能被稳定地转换成 sub-claim status。

Iteration

由于中间层的下一步就是物理层，因此这里必须进行严格的内容检查。

如果中间层中任何一个环节出现问题，例如 sub-claim 拆解不完整、Boolean 逻辑不准确、assay 与 sub-claim 不匹配、readout 不能支持判定、缺少 controls 或 criteria 不清晰，都应该进入 iteration，而不是直接进入物理层执行。

中间层的检查可以分成以下几类。

1. Claim-to-Sub-claim 逻辑检查

需要检查的问题包括：

例如，对于弱版本 IGF receptor claim：

support(C0) = supported(S1) OR supported(S2)

refute(C0) = refuted(S1) AND refuted(S2)

inconclusive(C0) = NOT support(C0) AND NOT refute(C0)

这个逻辑是合理的，因为只要支持 IGF-1 或 IGF-2 binding 中任意一个，就可以支持“该蛋白是某种 IGF ligand 的 receptor”这个较弱版本 claim。

但是，对于强版本 claim，就必须加入 activation 或 signaling：

support(C0_strong) = (supported(S1) OR supported(S2)) AND supported(S3)

否则，系统可能会把一个只能结合 IGF ligand、但没有 receptor activation 功能的蛋白错误地判断为 functional receptor。

2. Sub-claim-to-Assay 对齐检查

每一个 sub-claim 都需要至少有一个对应 assay。

需要检查的问题包括：

例如：

3. Assay 可执行性检查

Assay 需要足够具体，才能交给物理层继续转换为 protocol。

需要检查的问题包括：

4. 信源检查

Assay 选择需要有可追溯来源。

需要检查的问题包括：

可以为每个 assay 记录：

source_or_template:
  type: literature | database | internal_SOP | expert_defined_template
  citation: ...
  matched_components:
    - evaluant
    - analyte_or_ligand
    - readout
    - controls
  adaptations:
    - replaced ligand with IGF-1
    - changed readout from endpoint signal to dose-response curve
    - added competition control
  justification: >
    This assay template directly measures ligand-protein binding,
    which is aligned with the sub-claim that the candidate protein
    specifically binds IGF-1.

5. 结果模拟检查

在真正进入物理层之前，最好先做一次“结果模拟”。

也就是说，假设每个 assay 最后返回不同结果，检查系统是否能够根据这些结果自动判断最终 claim 的状态。

例如，对于弱版本 claim：

C0: This protein functions as a receptor for IGFs.

S1: This protein specifically binds IGF-1.
S2: This protein specifically binds IGF-2.

support(C0) = supported(S1) OR supported(S2)
refute(C0) = refuted(S1) AND refuted(S2)
inconclusive(C0) = NOT support(C0) AND NOT refute(C0)

可以模拟如下结果：

如果这个模拟表无法填写，或者填写后无法得到稳定判断，就说明中间层设计还不完整，需要回到 sub-claim 或 assay 层重新修改。

中间层的最终输出

一个完整的中间层输出，至少应该包含以下几个部分：

1. Sub-claim table
   • 每个 sub-claim 的 ID、statement、scope、support criteria、refutation criteria、inconclusive criteria。
2. Claim decision rules
   • 如何由 sub-claims 的状态组合得到最终 claim 的状态。
   • 最好使用 Boolean logic 或更明确的 decision rules 表示。
3. Assay table
   • 每个 sub-claim 对应哪些 assays。
   • 每个 assay 的 readouts、controls、replicates、criteria、resources 和 limitations。
4. Assay-source mapping
   • 每个 assay 来自哪个知识库、文献、SOP 或模板。
   • 如果做了 adaptation，需要记录 adaptation 的内容和理由。
5. Alignment report
   • 检查每个 assay 是否真的能支持或拒绝对应 sub-claim。
6. Simulation report
   • 模拟不同 assay 结果是否可以推出最终 claim 的状态。
7. Iteration flags
   • 标记哪些地方需要人工审查、补充信息或重新设计。

可以用下面这个结构概括中间层的工作流：

Claim
  -> decompose into Sub-claims
  -> define decision rules
  -> retrieve candidate Assays
  -> rank and adapt Assays
  -> define readouts and criteria
  -> validate Sub-claim-Assay alignment
  -> simulate possible outcomes
  -> output to physical layer

因此，中间层的核心任务可以总结为：

将概念层中的 claim 转换成一组可实验判定的 sub-claims，并为每个 sub-claim 匹配能够产生证据的 assay，同时定义清楚从 assay result 到 sub-claim status，再到 final claim status 的判断规则。

只有完成这一步之后，物理层才能真正开始生成 protocol、分配仪器、安排实验人员或调用自动化设备。